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BCECF具有4～5个负电荷，pH7～8，有助于在胞内滞留。其AM形式的乙酰酯衍生物具有膜透性，可以被动穿过细胞膜。且BCECF,AM本身不发出荧光，通过胞内酯酶作用后成为BCECF发出荧光信号，可以作为细胞活力的判断依据之一。

修饰AM乙酸酯集团上的羧酸，使之不带电荷，可以渗透进入细胞膜，一旦进入细胞，其亲脂保护基团可以被酯酶非特异性的脱去，成为带电荷形式，相较于原来的AM形式，带电荷形式在胞内可以更久的滞留。

BCECF也用于灌注组织，细胞间隙，植物细胞，对细菌和酵母进行pH测量。BCECF AM可以用于检测细胞生存能力，细胞毒性，凋亡、粘附和多药耐药性以及趋化性等多种功能性检测。

1. 7.0的pKa值是理想匹配到正常范围的细胞质的pH(约6.8～7.4)。
   
2. 荧光激发特性是pH依赖型，可以进行比率测定，可以进行比率测定。
   
3. 具有最大吸光度的BCECF碱形式激发谱非常接近488nm氩激发，适合应用于流式细胞仪和共聚焦显微镜。

中文名称：2',7'-双-(2-羧基乙基)-5-(6)-羧基荧光素
CAS号：117464-70-7
分子式：C₃₉H₃₅O₁₉
分子量：821

组分	规格
细胞pH荧光探针(BCECF,AM)	1mg
说明书	1份

保存：-20℃，避光，有效期1年。


BCECF,AM可用DMSO溶解为5mM的储液浓度，保存于-20℃，如需进行连续性实验，请尽快用完。如果储液在大于400nm下有很强的吸光度说明溶液中含有较多的水分，就必须被稀释立刻使用，而不能被储存。BCECF AM通常应该是无色无荧光信号。

哺乳动物细胞装载BCECF AM操作说明
大多数哺乳动物细胞可以通过孵育，加载入细胞膜透性BCECF AM，一旦其进入细胞内，非特异性的酯酶水解去AM前体，得到pH值敏感的，具有荧光信号的BCECF探针。一般来说，BCECF可以再胞浆内自由的游离分布并富集，而不能扩散到细胞外。

1. 制备活细胞悬浮液(10⁶细胞/mL)。注意：对象是贴壁细胞的话，条件与悬浮细胞类似。用PBS稀释AM加载溶液(参见步骤2)浸没贴壁细胞(或细胞爬片)。
   
2. 用PBS或者HBSS稀释1mM的AM原液100～500倍，制成AM加载溶液。一般来说，只要能获得足够的荧光信号即可，尽量选择最小浓度的AM酯(孵育浓度低至0.1μM也可以)，尽量减少AM酯的水解副产物(甲醛和乙酸)的富集。这里，含有氨基酸或者含有伯、仲胺的缓冲液都是必须避免的。因为脂肪胺可以促成AM酯的水解而阻止其加载到细胞内，并维持胞外的最低程度的AM酯水解。另外，血清等可能含有内源性酯酶活性的物质也必须避免。直到细胞加载AM酯完成之后。
   
3. 按体积比1:1将AM酯加入到细胞悬液中，4度~37度孵育15～60分钟。
   
4. 新鲜培养基洗涤细胞两次。

组织样本处理
组织样本的处理与哺乳动物细胞加载BCECF AM的方法类似。在这些实验中，将组织样本安置在灌注室，以1～5μM的BCECF AM灌流液灌注5～60分钟。随后通过未改性的灌流液充分的洗涤。对于细胞间质的pH测量来说，可以通过直接注射0.2～0.5mM的BCECF酸来加载一个短暂的脉冲，BCECF酸可以通过扩散作用被加载到分离的细胞或组织切片中，再通过到荧光成像仪成像或者电生理记录仪记录。

加载其他类型细胞
细菌：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都可以通过简单的酸休克反应：(0.5mM BCECF酸/5mM HCl处理5分钟)而加载上BCECF。染料显示冰上孵育时，可以很好地滞留胞内，但是在乳糖刺激下可以导致电位变化，继而导致染料自胞内快速流出。
酵母菌与真菌：尝试加载孵育浓度为：10μM的BCECF AM但是结果显示这两种菌对该染料的加载效果并不理想，可能是由于酵母细
胞内的酯酶水解效率较低，在Neurospora crassa真菌内加载的结果甚至不是均匀分布，而呈现空泡堆积的效果。
植物：培养悬浮原生质体：(2×10⁶个/mL)，利用低浓度10nM的BCECF AM可以得到均匀的胞内分布结果，高浓度的3μM的BCECFAM在加载到玉米根毛细胞中的结果显示基本富集于液泡中。

细胞内pH校准
BCECF具有pH依赖性的光谱位移，通过计算不同激发波下的荧光素发射波的光密度比率(计算方法1)，从而计算出pH变化情况。该比率计算公式中不考虑光漂白、非均匀的加载指示灯以及细胞厚度、仪器稳定行等影响因素。
公式(1)：

[H+]＝Ka	(R-RA)	×	FA(λ2)
	RB-R		FB(λ2)

其中，R是测得的比值，F(λ1)/F(λ2)，分别在两个波长λ1和λ2下测得的荧光强度F，下标A和B分别表示在酸性和碱性滴定
的终点值。需要注意的是，必须要减去背景荧光，校正计算R值。通常BCECF计算应该用到双激发比率，λ1=490nm，λ2=440nm，
其固定发射波长在535nm。荧光显微镜所用双激发滤光器可以参见Omega Optical Inc.(www.omegafilters.com，set XF16)和Chroma
Technology Corp.(www.chroma.com,set 71001)。
对于共聚焦显微镜，用442nm的氦-镉激光器与488nm的氩离子激光器进行组合激发。注意：这里，上面公式(1)中的λ2激发波
长选择pH非依赖性等色点(如，BCECF为439nm)而不是用标准化因子FA(λ2)/FB(λ2)。虽然BCECF的发射光对于pH的依赖性
要比激发光低得多，但是，在488nm的激发光下，其525nm/640nm的发射光谱比率也会偶尔应用于流式细胞仪上的pH计算。
公式(1)的对数形式为公式(2)：

pH＝pKa－Log	(R-RA)	×	FA(λ2)
	RB-R		FB(λ2)

在这里，可以得到一个线性图，斜率与截距pKa相等。控制胞外pH的缓冲液pKa为7.0，校准BCECF的荧光响应，。当然，由于染料荷载地进行，这种响应可能会发生变化，最好能够为每一次的实验体系进行原位校准，可以通过在离子载体存在的条件下，使用10～50μM离子载体尼日利亚菌素/100～150mM的钾盐将胞内pH与胞外对照培养基进行平衡。BCECF的原位校准方法在诸多文献中已见报道。

细胞功能分析
利用BCECF AM在胞内的酯酶水解特点可以判断细胞膜完整性、细胞活力指标等荧光细胞毒性试验。细胞毒性试验用BCECF可以应用于高通量的酶标仪，并提供快速便捷地代替51Cr释放实验。细胞粘附实验可利用BCECF AM的类似特点。一个典型的例子是：CHO细胞接种微孔板，然后再接种加载了2μM BCECF AM的鼠R1.1细胞，在37度条件下共孵育20～30分钟，将平板洗涤和检测结合滞留下来的R1.1细胞数，该细胞数与荧光强度正相关，可以用过荧光读数仪检测。
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